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    本生生物詳述培養基的制備、使用及保存!

    2020-03-25作者:瀏覽次數:121  來源:本生(天津)健康科技有限公司

    一、培養基的實驗室制備

    確制備培養基時微生物檢驗的最基礎步驟之一。使用脫水培養基和其他成分,尤其是含有有毒物質(如膽鹽或其他選擇劑)的成分時,應遵守良好實驗室規范和生產廠商提供的使用說明。培養基的不正確制備會導致培養基出現質量問題。

    1.水

    除特定要求,實驗室用水的電導率在25℃下應不高于25uS/cm(相當于電阻率≥0.4MΩcm)。

    微生物污染應不超過103CFU/mL,zui hao低于102CFU/mL。應根GB/T 5750.12或其他有效方法,定期檢驗微生物的污染。

    2.稱量和復水

    稱量所需量的脫水培養基(注意防止吸入粉末,尤其是含有有害物質的培養基粉末),先加入少量水,充分混合(注意避免培養基結塊)后再加水至所需的量。

    3.溶解和分裝

    脫水培養基加水后適當加熱,并不攪拌使其快速溶解,必要時,重新溶解。含瓊脂的培養基在加熱溶解前應浸泡幾分鐘。

    4.pH的測定和調整

    用pH計測定pH,必要時在滅菌前調節pH,除特殊說明外,培養基滅菌后冷卻至25℃時,要求pH的變化不超過0.2pH單位.通常使用濃度約為40g/L( 約1 mol/ L)的HNA溶液或濃度約為36.5g/L(約1mol/L)的鹽酸溶液調節pH。如果滅菌后調節pH,溶液需滅菌。

    注:商品化培養基在高壓滅菌前后pH可能發生明顯變化,但使用蒸餾水或去離子水時,滅菌前無需調節pH。

    5.分裝

    將配置好的培養基分裝到適當的容器中,容器的體積至少為體積的1.2倍。

    6.滅菌

    ①概述

    培養基和試劑的滅菌通常采用濕熱滅菌或過濾滅菌。

    有些培養基無需高壓滅菌,可煮滅菌。如,含亮綠的腸道菌培養基對光和熱特別敏感,應在煮沸后快速冷卻,避光保存。同樣,一些試劑則不需要滅菌,直接使用(參見相關標準或生產廠商的使用說明)。

    ②濕熱滅菌

    濕熱滅菌在高壓鍋或培養基制備器中進行。高壓霉菌一般采用121℃±3℃霉菌15min。如果培養基的體積超過1000mL,要對滅菌條件進行適當的調整。所有操作均要按照標準和使用說明的規定進行。

    注:大容量培養基(>1000mL)滅菌時可能會造成過度加熱。

    加熱后應采取適當的方式冷卻,防止沸溢。這對大容量培養基和敏感性培養基(如含亮綠的培養基)是非常重要的。

    ③過濾滅菌

    過濾滅菌可以在真空負壓或正壓條件下進行。使用無菌設備和0.2um孔徑的濾膜。將過濾裝置的各個部分消毒滅菌,或使用預消毒設備。

    一些濾膜上附著蛋白質或其他物質(如抗生素)。為達到有效過濾,應事先將濾膜用無菌水潤濕。

    ④監測

    應對經濕熱或過濾滅菌的培養基進行監測,尤其要對pH、色澤、滅菌效果和均勻度等指標進行監測。

    7.添加劑的制備

    制備含有有毒物質(特別是抗生素)時應小心操作,避免因粉末的擴散造成實驗人員過敏或發生其他不良反應。采用適當的預防措施并小心按照產品使用說明操作。不要使用過期的試劑;抗生素工作溶液現配現用;批量配置的抗生素溶液分裝后向冷凍保存,但解凍后的貯存溶液不可再次冷凍;廠商應提供冷凍對抗生素活性影響的相關資料,也可由使用者自行測定。

    二、培養基的使用

    1.瓊脂培養基的融化

    將培養基放到沸水浴中或采用其他有相同效果的方法(如高壓鍋中的蒸汽)融化。經過高壓滅菌的培養基盡量減少重新加熱的時間,避免過度加熱。培養基融化后立即移開,室溫靜置片刻(約2min),以免玻璃容器發生破裂。

    融化后的培養基放入47℃~50℃恒溫水浴鍋中保溫,冷卻到47℃~50℃所需的時間取決于培養基的類型、體積和在水鍋里的分裝量。融化后內培養基應盡快使用,放置時間一般不超過4h。剩余的培養基固后不得再次融化使用。特別是靈敏性培養基,應根據相關標準,縮短融化后放置的時間。

    將瓊脂培養基倒入類似檢測培養使用的獨立容器中,插入溫度計,記錄并保存瓊脂的融化溫度。

    加入樣品的培養基應將溫度調節到44℃~47℃,或按照相關標準調節溫度。

    2.培養基的脫氣

    必要時,在使用前將養基放到沸水浴或蒸汽浴中加熱15min,加熱時松開容器蓋子;加熱后蓋緊蓋子,并迅速冷卻至使用溫度。

    3.添加成分的加入

    對熱不穩定的添加成分應在培養基冷卻至47℃~50℃時加入,滅菌的添加成分加入前應冷卻至室溫,避免冷的液體會造成瓊脂凝膠或形成片狀物。將添加成分慢加入培養基并充分混勻,盡快分裝到待用的容器中。

    4.培養基的棄置

    所有污染和未使用的培養基的棄置應采用安全的方式,并符合相關法律法規的規定。

    三、平板的制備和儲存

    傾注融化后的培養基到平皿中,使之在乎皿中形成一個至少3mm厚度的瓊脂層(直經90mm的平皿通常要加入18mL-20mL瓊脂培養基),或根據相關標準要求制備平皿。將平皿蓋好皿蓋后放置在水平平面使指冷卻凝固。如果平板要儲存、培養時間超過48h或培養溫度超過40℃,要增加培養基的傾注量。

    注:在培養過程中,瓊脂培養基會損失水分,在某些環境條件下會影響微生物的生長。,造成培養基水分損失的因素很多,如培養基的成分、平皿中培養基的量、培養箱的類型(如使用帶風扇的培養箱)、培養箱里的空氣濕度、平皿在培養箱中放置的位置和數量以及培養溫度等。

    四、疑難解答

    1.培養基不能凝固

    ①培養基制備過程中過度加熱

    ②低pH值造成培養基酸解

    ③瓊脂使用量不正確

    ④瓊脂未完全溶解

    ⑤培養基成分未充分混勻

    2.pH值不正確

    ①培養基制備過程中過度加熱

    ②水質不佳

    ③外部化學物質污染

    ④在不正確溫度下測量pH值

    ⑤pH計未正確校準

    ⑥脫水培養基質量差

    3.顏色異常

    ①培養基制備過程中過度加

    ②水質不佳

    ③脫水培養基質量差

    ④pH值不正確

    ⑤外來污染

    4.產生沉淀

    ①培養基制備過程中過度加熱

    ②水質不佳

    ③脫水培養基質量差

    ④pH值未正確控制

    ⑤如果是各別成分制備的培養基---原材料不純

    5.培養基出現抑制/生長率低

    ①培養基制備過程中過度加熱

    ②水質不佳

    ③脫水培養基質量差

    ④配方使用不對

    ⑤添加成分不正確,如加入添加成分時培養基過熱或添加濃度錯誤

    ⑥添加物被污染

    6.污染

    ①滅菌不充分

    ②無菌操作有誤

    ③添加物被污染產品優勢:

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